培養(yǎng)基的配置：基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml
凍存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超凈工作臺(tái)常規(guī)配置
移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺(tái)，斜架1臺(tái)，酒精噴壺1個(gè)，酒精棉球缸1個(gè)，污缸1個(gè)，
常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶（50㎝²），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，保種管
所需試劑：gibco高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
所需的各項(xiàng)高壓后的耗材放于超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精噴壺噴灑實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，并關(guān)閉工作臺(tái)打開紫外燈照射30min后開始實(shí)驗(yàn)操作。
**傳代前細(xì)胞的復(fù)蘇，shou先用一大燒杯盛滿37℃的溫水放于液氮罐旁邊，待細(xì)胞株取出后留上端1/3于37℃水面上盡**大速搖動(dòng)管使其在2min內(nèi)迅速融化。若種管頂部含有凍存的細(xì)胞液在搖動(dòng)期間用力甩動(dòng)使其降于管底后再搖動(dòng)。這一過程可在超凈工作臺(tái)外操作。
實(shí)驗(yàn)步驟
一、原代細(xì)胞的培養(yǎng)
1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
2. 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈**近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3. 取1個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側(cè)，把保種管在超凈臺(tái)外用酒精棉球擦拭下2/3后拿進(jìn)超凈臺(tái)內(nèi)在酒精燈上消毒保種管口2-3次放于臺(tái)面左手邊，取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取保種管內(nèi)的細(xì)胞液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
4. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。
5. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
6. 將培養(yǎng)瓶放于28℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。
 
 
在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h，瓶蓋擰緊后拿出培養(yǎng)箱，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，及細(xì)胞形態(tài)。**后更換培養(yǎng)液。
 
二、 培養(yǎng)液的更換
 
1． 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
2． 將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈**近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)
 
3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，
4． 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放。
5． 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
6. 將培養(yǎng)瓶放于28℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。
 
 
每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。
三、 細(xì)胞傳代
1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈**近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
4.  將培養(yǎng)瓶平放使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的**適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直**出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的**佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。#p#分頁標(biāo)題#e#
5. 吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。
6. 取2或3個(gè)高壓后的新培養(yǎng)瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側(cè)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)基均勻的分到3或4個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（注意原來傳代時(shí)使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用），進(jìn)行1傳3或1傳4的培養(yǎng)。
7. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動(dòng)移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個(gè)定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶?jī)?nèi)吸取4ml培養(yǎng)基懸空移入每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。
8. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
9. 將培養(yǎng)瓶放于28℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。注意整個(gè)培養(yǎng)箱底托盤內(nèi)一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。
 
 
每天定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代或保株。
 
四、 細(xì)胞株的保存
1. 紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
2. 將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺(tái)面內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對(duì)準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對(duì)準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈**近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動(dòng)在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
4.  將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個(gè)瓶壁的細(xì)胞層，計(jì)時(shí)約40s，立馬豎起對(duì)著燈光可觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個(gè)細(xì)胞脫落，這時(shí)為胰酶消化的**適時(shí)機(jī)。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細(xì)胞脫落，則需繼續(xù)消化，輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后迅速豎起對(duì)著燈光觀察細(xì)胞情況，可反復(fù)幾次，直**出現(xiàn)針孔樣縫隙和1-2個(gè)細(xì)胞脫落的**佳消化狀態(tài)。用移液器將胰酶吸凈。
5. 吸取1ml細(xì)胞凍存液于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞完全脫落于培養(yǎng)基內(nèi)再輕輕吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個(gè)懸浮狀態(tài)。
6. 將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實(shí)驗(yàn)標(biāo)記。
7. 將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，取出實(shí)驗(yàn)試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。
8. 將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，**后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長(zhǎng)期保存。
注此過程也可簡(jiǎn)化因?qū)嶋H操作過程中經(jīng)驗(yàn)所得：步驟7結(jié)束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月。
 
 
五、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
操作前：紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺(tái)正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。
1. 預(yù)混液A  fugeneHD 5ul/孔 +  OPTI-MEM  45ul/孔 室溫溫育10min
2. 預(yù)混液B  arr 16ul/孔  +  OPTI-MEM  34ul/孔   室溫溫育5min
3. 預(yù)混液C  空載 16ul/孔 +  OPTI-MEM  34ul/孔  室溫溫育5min
4. 預(yù)混液D  arr 12ul/孔 + ops 12ul/孔 + OPTI-MEM 26ul/孔室溫溫育5min
注：fugeneHD為轉(zhuǎn)染試劑 ，arr，空載，ops為模板？OPTI-MEM為空培養(yǎng)基
5. 將步驟2,3,4中的預(yù)混液B,C,D中分別加入步驟1中的等體積的預(yù)混液A，輕柔混勻，室溫溫育15min，再次輕柔混勻后室溫溫育15min。
6. 取出6孔培養(yǎng)板，將每培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基全部吸凈，無殘留，是為了防止殘留的雙抗和胎牛血清影響轉(zhuǎn)染效果。加入1.5-2.0ml/孔的OPTI-MEM 到6孔培養(yǎng)板內(nèi)，輕輕搖勻。
7. 將步驟5中再次混勻溫育結(jié)束的預(yù)混液B,C,D,分別以100ul/孔， 加入目的培養(yǎng)孔中（空載，目的質(zhì)粒，48h 72h），按上下，左右，斜對(duì)角的方向輕輕搖勻。
8. 28℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育6-8h后。細(xì)胞換液為完全培養(yǎng)基。
 
 
另外，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例為5ul：2ug，此時(shí)包被效果**佳。
一般，細(xì)胞培養(yǎng)48h收RNA，72h收蛋白。