ES 細胞培養

A.FBS的滅活與分裝
1.化凍
將血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）從－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍過夜；也可室溫（或浸于自來水中）化凍，化凍后若不馬上滅活，可以放入4℃冰箱暫時保存；
 
2.滅活
 
（1） 放入室溫的水浴鍋內開始加熱（同時放入一個內裝200 ml自來水的血清瓶，插入一根溫度計，溫度監控以此為準）；
（2） 當溫度計顯示56℃時，控制在此溫度30分鐘±3分鐘；若不小心使溫度上升超過56℃，則：若仍未超過60℃，且時間很短（比如：不超過5分鐘），則仍可使用；若超過60℃，或者時間較長，則棄去不用，或者嘗試用于ME細胞的培養；
（2） 取出，自然冷卻**室溫（約需1－3小時），可分裝或－20℃繼續凍存；
 
3.分裝
 
（1）轉入細胞間，用移液器將血清分裝，注意預先要將血清輕輕搖動數周、混勻；吹出血清時要注意：不要吹出氣泡（血清很粘稠，很容易產生氣泡；如果已產生氣泡，則在酒精燈火焰上過一下）；標好批號和日期；
（2）放入－20℃冰箱凍存(分裝一次大約可以使用1—2個月)。
 
B. 配制DMEM血清培養基
1.提前**將分裝好的FBS從—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化凍；
2.在細胞間中將FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸鈉、抗生素等），按照比例加入DMEM培養基中，作好標簽；放入4℃冰箱保存。
配制比例如下：
 

C.原代胚胎成纖維細胞（ME）的制備
1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死；
2. 將鼠腹面向上放置，70% 酒精潤濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚，污染內臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉入無菌10cm平皿中；
3. 把平皿轉入超凈臺；
4. 用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；
5. 將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次；
6. 棄去PBS，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗**溶液基本無色（1－4次）；
7. 加入適量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），體積約等于組織塊體積；
8. 用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1－10分鐘（或消化**溶液渾濁變粘），加入與消化液等體積培養基，輕輕吹打混勻（5－10次），靜置；
9. 沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉入離心管中。
10. 將細胞懸液管離心（1000轉5分鐘）；
11. 棄去上清，向沉淀中加入適量培養基，輕輕吹打重懸，將其分種**10 cm細胞培養皿，補加適量培養基，作標簽（ME－0；注意：若凍存，則可以使用復蘇后的0代ME制作Feeder；若直接使用則**好不用0代ME細胞做Feeder，要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好），轉入培養箱培養；
12. 視細胞生長情況換液（一般3天換液一次），若細胞已長滿，則凍存，或者1：3-5傳代（視細胞疏密而定），放入培養箱繼續培養（此后不用再換液）；1－5代的ME細胞均可用來制作Feeder。#p#分頁標題#e#
 
飼養層細胞（Feeder）的制備
注：含10 ug/ml絲裂霉素C的DMEM血清培養基（FBS占10%）（實驗室所用MMC為10 mg/mL，Calbiochem）
 
1.棄去細胞培養皿中的培養液，加入適量含10ug/ml絲裂霉素C的培養基（DMEM+10% FBS）；
2. 放入培養箱培養3小時（2－4小時）；
3. 用0.1% 明膠處理培養皿（將明膠加入，搖動使明膠覆蓋全部皿底，然后吸出明膠棄去即可），室溫放置2小時以上，**皿底明膠干燥為止；
4. 棄去含有絲裂霉素C的培養基，加入2－3 mL PBS，輕輕搖動，棄去PBS，如此洗3-5次（必須洗3次以上，以便徹底洗去殘存的絲裂霉素，絲裂霉素是有絲分裂抑制劑，因而對ES細胞有毒性）；
24. 加入適量胰酶消化30秒，吸去消化液，靜置**細胞層出現裂縫或明顯滑壁為止，加入培養基，吹打，種**明膠處理過的培養皿中即可（如細胞過稀，可再補加絲裂霉素處理過的細胞），半小時后即可使用（如果急用，則可以用ES細胞培養基終止消化，然后與ES細胞一起轉入明膠處理過的新板上），可使用6－10天，用前更換培養液（如未用明膠處理培養皿，則需在培養箱中放置2小時以上方可使用；**好是前**下午制作Feeder，第二天上午使用，這時的Feeder狀態**好，**適于ES細胞貼壁生長，而且萬一制作的Feeder在第二天早上發現出了問題，還可以趕緊補做）。
 
ES細胞培養基
DMEM+15%FBS  
FBS：   gibco Fetal Bovine Serum, ES Cell-Qualified 500ml 10439-024
2-巰基乙醇：5.5uM 1000X Gibco 21985-023
L-谷氨酰胺：2mM 100X Sigma G8540   GluMAX 35050-061(GIBCO)
LIF：1000U/mL 10000X Chemicon ESGRO® (LIF); 10E7 units，貨號:ESG1107
非必需氨基酸：100uM 100X Gibco 11140-050
雙抗： 100X Gibco 15070-063
丙酮酸鈉                100x    Gibco 11360-070
絲裂霉素：   sigma M4287-2MG 1330.29  M4287-5X2MG 5875.74
明膠：sigma G9391 G1393 gelatin solution
胰酶 gibco 15400-054
PBS：14190-144 gibco
TrypLE™ - Phenol Red   gibco 500ml 12605-028
DMSO     sigma C6164-50ML
ES細胞的復蘇
1. 提前制備好相應數量的Feeder；
2. 準備37－39℃的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管（凍存細胞），迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動直**凍存液全部融化；
3. 轉入無菌間，1000轉/分鐘離心5-10分鐘；
4. 棄上清，加入1 ml ES培養液輕輕吹打重懸，轉入鋪有飼養層細胞的培養皿中（凍存前細胞來自多大的培養皿，復蘇時就用相應大小的培養皿），補加適量培養液；
5. 轉入培養箱培養，次日換液；此后每24小時換一次液，每48小時傳一次代（視生長情況）。
 
ES細胞的換液
1. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內）；
2. 細胞培養皿從培養箱內取出，相差顯微鏡下作常規觀察（判斷生長情況，并確證未發生污染）后轉入無菌操作臺內；
3. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去，換新鮮培養基（6 cm培養皿約5 mL，3.5 cm培養皿約3 mL培養基；若死細胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養基）；
4. 放回培養箱繼續培養。
 
ES細胞的傳代
1. 前**下午做好所需數量的Feeder細胞板；
2. 提前半小時左右將培養基從4℃冰箱取出，放于室溫（或者放于37℃溫箱內）；
3. 將ES細胞培養皿、Feeder細胞培養皿從培養箱內取出（相差顯微鏡下作常規觀察，Feeder細胞應生長良好，細胞覆蓋95%左右，**少90%以上的培養皿面積）；ES細胞應生長良好，接近長滿培養皿，細胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規則、呈橢圓形、邊緣光滑、表面光滑，細胞生長致密、核大、胞質少；
4. 將ES細胞培養皿內的液體吸出、棄去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去；再作用1—5分鐘，不時觀察，待細胞層（皿底一層白色臟東西樣膜）出現裂縫并明顯開始下滑時，補加培養基，適度吹打（視消化程度及管口粗細而定，**看不到明顯的大的細胞團塊為止）；平均分到Feeder培養皿中（滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來），滴加補加培養基**5 ml左右（滴加，以免將Feeder細胞吹脫落下來；若為3.5cm培養皿，則補加**3ml左右），作好標簽；
5. 前后左右水平晃動培養皿，使ES細胞均勻分布于培養皿中，放入培養箱繼續培養。
 
ES細胞的凍存
1. 常規方法將細胞消化成單細胞懸液；
2. 轉入試管，1000轉/分鐘離心5分鐘；
3. 配適量凍存液（為含10% 二甲亞砜（DMSO），10% FBS的DMEM培養液）；
4. 棄上清，每管加入1ml凍存液，吹打成細胞懸液（只要使ES細胞分散成3—5個細胞的小團塊即可），轉入凍存管，作好標簽；
5. 放入程序凍存盒內24小時后轉入液氮罐中凍存。