細(xì)胞培養(yǎng)常見污染

細(xì)胞污染的類型
一、細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染。一開始就要十分重視，防止污染，否則會(huì)前功盡棄，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚**造成無法彌補(bǔ)的損失。即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴尽?*常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。
培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變而呈現(xiàn)黃色。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，**后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。一般細(xì)菌污染進(jìn)程很快，大約污染一兩天后肉眼就能顯著觀察到。

二、真菌污染
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中**常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。**常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間（發(fā)生卵圓形物體污染的幾率很大）。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但**后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

三、支原體污染
支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的**小微生物，**小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6～8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。
培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。

四、病毒污染
采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

五、非同種細(xì)胞污染
由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。
非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。

污染來源及鑒別
一、污染來源
細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：
1、不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本
很多動(dòng)物組織本該是無菌的(直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外)，但由于取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。
2、空氣
空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不徹底也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。
4、操作
來自操作者的污染主要有以下幾方面：
1、器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理。
2、操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。
3、培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。
4、操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。
5、細(xì)胞傾液時(shí)倒出培養(yǎng)瓶或者滴落在超凈臺(tái)上，未及時(shí)擦凈或者灼燒。
6、灼燒的火不夠旺。
7、移液管吸取液體時(shí)將空氣中的氣流吸入培養(yǎng)瓶中。
8、長時(shí)間的將離心管放在離心機(jī)中，可能由于口沒有完全封閉而造成污染。
9、同一根吸管或者放置吸管的離心管長時(shí)間使用造成的一管污染多瓶細(xì)胞交叉污染。
10、操作者操作時(shí)大聲說話，來回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等。
5、血清，市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。

二、污染的鑒別#p#分頁標(biāo)題#e#
1、細(xì)菌、真菌污染的檢測
（1）肉眼觀察  細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
（2）鏡下觀察  在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。
（3）接種觀察  采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。
2、支原體污染的檢測
（1）相差顯微鏡觀察  將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支持物(一般用長形蓋玻片)，24小時(shí)后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。
（2）熒光染色法觀察  用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258，DAPI或者PI等核染色試劑，染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。
（4）電鏡檢測可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法。
（5）培養(yǎng)檢測  將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。
培養(yǎng)加熒光核染色是檢測支原體污染的黃金搭檔。

污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的**好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到**小程度。在超凈臺(tái)中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，特別注意在進(jìn)行移液，傾倒液體的操作過程會(huì)產(chǎn)生飛沫并沉積在超凈工作臺(tái)內(nèi)物體的表面。超凈工作臺(tái)的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會(huì)隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺(tái)不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會(huì)破壞超凈工作臺(tái)氣流的方向?qū)е嘛w沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動(dòng)、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺(tái)內(nèi)物品污染的主要因素造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應(yīng)盡可能減少超凈工作臺(tái)內(nèi)的物品。不同細(xì)胞系以及同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用，如胰酶、培養(yǎng)液等。否則，一個(gè)操作者的失誤可能引起所有細(xì)胞發(fā)生污染。
一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

無菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以5% 新潔爾滅擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以5% 新潔爾滅擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(tái)(**少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。#p#分頁標(biāo)題#e#
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
7.無菌室的徹底消毒
1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室；
2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細(xì)菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。

常見的污染如下：
1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。
仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！
可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理

2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長，但時(shí)間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。
其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個(gè)別污染，可能是操作問題，就要注意操作

3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，G內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中**常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/ml Tylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。

4、黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號(hào)的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。

5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

6、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長，**終形成惡性循環(huán)。

污染的清除
　　培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。
一、細(xì)菌和真菌的清除
　　1、使用抗生素，抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。
二、支原體的清除
　　１、用MRA處理，用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康．效果好．
　　2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
　　細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌
　　其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低**極限.如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
　　3、藥物輔助加溫處理，先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。
　　4、使用支原體特異性血清，用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。#p#分頁標(biāo)題#e#

細(xì)胞污染圖片