5.1總則

5.1.1清潔所有必需的玻璃器皿，并按照SOP進行去熱原，以便對玻璃器皿進行去熱原。
5.1.2將所有無熱原玻璃器皿轉移到BET室。
5.1.3開關“ON”加熱塊按照操作用于指令的SOP 加熱塊，并在37設定的溫度°C
5.1.4 MVD計算為下述式樣品試樣-
5.1.5用LRW將待測樣品稀釋至四分之一MVD，并在渦旋振蕩器上振蕩3分鐘。
5.1.6注射用水的取樣和測試：按照取樣計劃，將注射用水樣品收集在去熱原的小瓶或試管中。注射用水應  根據分析方法進行測試。

5.2制定控制標準（CSE）

5.2.1按照制造商提供的瓶子和制造商提供的說明中的說明重新配制LRW中的CSE，并間歇渦旋30分鐘。
5.2.2重構后4周內使用重構后的CSE。
5.2.3用LRW制備CSE稀釋液以產生1EU / ml，并在渦旋中搖動稀釋液3分鐘。
5.2.4通過稀釋體積制備4λ，相當于從1 EU / ml到LRW的4λ濃度。將稀釋液在漩渦中搖動3分鐘。（4λ由l濃度反算，即λ是裂解物的靈敏度）。

5.3裂解液的重建

5.3.1現在，在無菌刀片的幫助下，通過打開裂解液的鋁質封口來重新配制裂解液。
5.3.2通過在堅硬的表面上敲擊，將裂解物粉末收集到樣品瓶的底部。然后慢慢打開軟木塞。
5.3.3按照制造商的說明，在使用前添加LRW或緩沖溶液，并立即更換軟木塞。

5.4標記的裂解液敏感性的確認

5.4.1重復四次確認，然后在測試中使用裂解物溶液的標記靈敏度λ，以EU / ml或IU / ml表示。當使用新一批的裂解物或實驗條件發生任何變化而可能影響測試結果時，必須進行裂解物敏感性的確認。
5.4.2通過將一系列CSE溶液用水稀釋成BET（LRW），用至少四種等于2λ，λ0.5λ和0.25λ的濃度的4λ溶液制備CSE稀釋液。
5.4.3取10個去熱原化驗管，并通過編號對管進行標記并將其一式四份排列在架子上，然后按照下表進行操作-?
5.4.4分別將100 ml稀釋的CSE（即分別為2λ，λ，0.5λ和0.25λ）移入去熱原的試管（10 mm x 75 mm）中，并進行相應標記。對于NWC（負水控制），請分別使用100 ml LRW，并一式四份進行測試。
5.4.5在每個試管中加入100毫升重構的裂解液，并輕輕混合。
5.4.6將反應混合物在37°±1°下恒溫孵育60±2分鐘，避免振動。
5.4.7孵育后，取每個試管，直接從培養箱中轉過來，以一個平穩的動作將其翻轉大約180°。如果形成了牢固的凝膠，該凝膠在反演后仍保留在原位，則記錄結果為陽性。如果未形成完整的凝膠，則結果為陰性。
5.4.8除非zui低濃度的標準溶液在所有重復測試中均顯示陰性結果，否則該測試無效。
5.4.9終點是內毒素濃度下降系列中的zui后一個陽性結果。使用以下表達式計算終點濃度的對數平均值，然后計算平均值的對數：
5.4.10幾何平均終點濃度是裂解物溶液的測量靈敏度（EU / ml或IU / ml）。如果其不小于0.5λ且不大于2λ，則確認標記的靈敏度并將其用于用該裂解物進行的測試中。

5.5測試程序

5.5.1如表1，
表– 1 所示制備溶液A，B，C和D
5.5.2取8根去熱原的化驗管并編號，并在對置的架子上進行標記。例如，NPC為1＆2，PPC為3＆4，PWC為5＆6，負水控制為7＆8。
5.5.3在NPC和PWC中加入50毫升LRW，在NWC中加入100毫升。立即添加50 ml產品樣品，將其在NPC和PPC中以MVD / 4稀釋，然后添加50ml CSE，將其在PPC和PWC中稀釋至4λ。
5.5.4zui后在所有試管中加入100 ml裂解液，然后用手混合測定管并在加熱塊中孵育，在加熱塊中將溫度保持在37±1°C保持60±2分鐘。

5.6結果解釋

5.6.1凝膠凝塊法中的每個試管均被解釋為陽性或陰性，陽性試驗表明形成牢固的凝膠，當試管倒置180°時能夠保持其完整性。
5.6.2陰性測試的特征是不存在凝膠或形成粘性物質，當試管在180°倒置時粘性物質不起作用。
5.6.3除非兩個陽性對照溶液B和C的兩個重復均為陽性，而陰性對照溶液D的兩個重復均為陰性，否則該測試無效。
5.6.4當溶液A的兩個重復均發現陰性結果時，所檢查的制劑符合測試要求
。5.6.5溶液A的兩個重復均發現陽性結果時，則不符合測試要求。
5.6.6如果溶液A的一個重復試驗發現陽性結果，而另一溶液的陰性結果重復試驗。如果在重復測試中溶液A的兩次重復均發現陰性結果，則所檢查的制劑符合測試要求。

5.7故障調查

5.7.1當在兩個測試準備試管上都觀察到陽性結果時，通過檢查以下參數來調查其失敗的原因。
5.7.2檢查產品稀釋度，CSE稀釋度和裂解物稀釋度。
5.7.3是否按照SOP對玻璃器皿進行了清潔和去熱原處理。
5.7.4檢查裂解液批次和匹配的CSE的敏感性報告。
5.7.5檢查加熱塊溫度和校準。
5.7.6檢查微量移液器校準。
5.7.7檢查是否有微生物學家污染。

5.8注意事項

5.8.1復水的CSE可以在2至8°C下保存28天。
5.8.2提供的COA專門用于裂解液批次和CSE批次。因此，使用相同的批次進行測試
5.8.3請勿渦旋裂解液。

5.9頻率

5.9.1裂解物敏感性的確認–每批貨物。
5.9.2按照注射用水抽樣計劃。
5.9.3成品和原材料按批次進行。

6.0縮寫

SOP：標準操作程序
QA：質量保證
QC：質量控制
NA：不適用
BET：細菌內毒素測試
CSE：對照標準內毒素
MVD：zui大有效稀釋液
LRW：Lal試劑水
PPC：陽性產品對照
NPC：陰性產品對照
PWC：陽性水控制
NWC：負水控制