摘要：動物細胞培養(yǎng)是指在體外培養(yǎng)動物細胞的技術，即在無菌條件下，從機體中取出組織或細胞，或利用已經(jīng)建立的動物細胞系，模擬機體內(nèi)的正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓細胞在培養(yǎng)容器中生存、生長和繁殖的方法。

動物細胞培養(yǎng)開始于本世紀初，到1962年規(guī)模開始擴大，發(fā)展**今已成為生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法，利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術產(chǎn)業(yè)的重要部分。由于動物細胞體外培養(yǎng)的生物學特性、相關產(chǎn)品結構的復雜性和質(zhì)量以及一致性的要求，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術仍然難于滿足具有重要醫(yī)用價值生物制品的規(guī)模生產(chǎn)的需求，迫切需要進一步研究和發(fā)展細胞培養(yǎng)工藝。目前，世界眾多研究*域集中在優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率并保證其質(zhì)量和一致性上。
本文介紹了關于動物細胞培養(yǎng)技術的起源史，動物細胞培養(yǎng)的技術基本概念，當前培養(yǎng)技術的特點、環(huán)境和生長條件、方式，以及現(xiàn)代化的動物細胞培養(yǎng)技術的應用現(xiàn)狀和存在的問題與展望。從而讓更多的人了解技術的使用，使我們這項技術得到更廣更好的發(fā)展。
 
Abstract：Animal cell culture refers to a culture of animal cells in vitro techniques，namely under aseptic conditions, was removed from the body tissue or cells, or using the animal cell lines have been established, the basic conditions for survival under the normal physiological condition of the body of the simulator,cell survival, growth and reproduction in the culture vessel.
          Animal cell culture starts at the beginning of this century, the 1962 scale began to expand, the development has become widely used in bio-medical research and application technology, the use of animal cell culture production of an important medical value of enzymes, growth factors, vaccines and monoclonal antibody, has become an important part of the medical and biological high-tech industry. Biological characteristics of animal cells cultured in vitro, the complexity and the quality and consistency of the requirements of the product structure, large-scale cultivation of animal cells is still difficult to meet the demand scale production of an important medical value of biological products, there is an urgent need for further research and The development of cell culture technology. Currently, many of the world's research focuses on the optimization of the cell culture environment, changes in cellular characteristics, to improve the yield of the product and to ensure its quality and consistency.
      This paper introduces the history of the origin of animal cell culture technology, animal cell culture technology concept, the current culture characteristics, environment and growth conditions, means, and the modernization of animal cell culture technology and the existing problems of application and Prospect of. In order to let more people understand the use of technology, so that we the technology get more and better development.
 
關鍵詞：動物細胞、培養(yǎng)特點、條件、方式、生物反應器、面臨問題、研究進展
 
 
一．基本概念
 細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞模擬體內(nèi)生存環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖并維持結構和功能的一種培養(yǎng)技術。從體內(nèi)取出細胞**培養(yǎng)即為原代培養(yǎng)，這是細胞培養(yǎng)的**初和必經(jīng)階段。當原代培養(yǎng)細胞生長到一定時期，受到群體環(huán)境限制，就需要轉(zhuǎn)移到另一容器才能繼續(xù)生長，稱為傳代或繼代培養(yǎng)。根據(jù)原代培養(yǎng)物性狀的一致性與否，傳代成功后稱為細胞系或細胞株。這些細胞一般可順利傳40—50代次，并保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制，傳**50代左右時則出現(xiàn)生長停滯，大部分衰老死亡，此類稱為有限細胞系/株；在細胞傳代過程中，有些發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增值能力的細胞稱為無限細胞系/株。
二．動物細胞培養(yǎng)的特點
動物細胞屬于真核細胞，結構和成分更復雜，功能也更全面。動物細胞之間的連接形式要比植物細胞復雜的多，主要有緊密連接、間隙連接、隔壁連接、中間連接和橋粒連接五種形式。緊密連接、間隙連接和橋粒連接相對普遍，隔壁連接僅見于無脊椎動物細胞，中間連接見于脊椎動物細胞。動物細胞具有以下特點：
1、動物細胞比微生物細胞大，無細胞壁。
2、動物細胞倍增時間長，生長緩慢。
3、培養(yǎng)過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。
4、動物細胞間主要以聚集體形式存在。
5、原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
6、動物細胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。#p#分頁標題#e#
7、對于培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等。
8、細菌、真菌、病毒、支原體均可導致動物細胞培養(yǎng)物的污染。
9、jue大多數(shù)哺乳動物細胞只有貼附在固體或半固體的表面才能生長。
體外培養(yǎng)的細胞從適應環(huán)境、旺盛生長到由于自身和環(huán)境限制緩慢或停滯生長需要經(jīng)歷一個周期變化，可分為：潛伏期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期。
潛伏期：細胞從接種到適應新環(huán)境生長繁殖的一段時間，此間細胞胞質(zhì)回縮，代謝緩慢。
指數(shù)生長期：它是細胞活力**好的時期，細胞增殖旺盛，在接種細胞數(shù)量適宜的情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3—5天后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，營養(yǎng)環(huán)境惡化，呈現(xiàn)接觸抑制，惡性細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制。
穩(wěn)定期:細胞數(shù)量達到飽和密度后，細胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，pH值下降，細胞停止增殖，進入停滯期，營養(yǎng)環(huán)境繼續(xù)惡化后，細胞受損直**死亡。
三．細胞培養(yǎng)環(huán)境和生長條件
1、無毒無菌環(huán)境：無毒無菌的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的shou要條件。在體外培養(yǎng)的細胞，由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物和有毒物污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，就可能會導致細胞中毒死亡，因此，在體外培養(yǎng)細胞時，應即時消除細胞代謝產(chǎn)物，以保證細胞生長環(huán)境無菌無毒。
2、恒溫：要維持培養(yǎng)的細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度，與多數(shù)哺乳動物體內(nèi)溫度相似，培養(yǎng)細胞的**適溫度為37℃。實踐證明，細胞對低溫的耐受性要比對高溫的耐受性強些，低溫下會使細胞生長代謝速率降低，一經(jīng)恢復正常溫度時，則細胞會再行生長。高溫對細胞威脅很大，若在40℃左右，則在幾小時內(nèi)細胞便會死亡。
3、pH：細胞培養(yǎng)的pH**適為7.2~7.4之間，多數(shù)類型的細胞對偏酸性的耐受性較強，而在偏堿性的情況下則會很快死亡。
4、氣體：細胞的生長代謝離不開O2。作為代謝產(chǎn)物的CO2還有調(diào)節(jié)pH的作用。CO2培養(yǎng)箱可根據(jù)需要持續(xù)地提供一定比例的CO2氣體，這樣便可以將培養(yǎng)環(huán)境中的氫離子濃度保持恒定以提供一個比較穩(wěn)定的pH范圍。
5、培養(yǎng)基：動物細胞對營養(yǎng)的要求較高，培養(yǎng)液里的成分要滿足細胞進行糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝及核酸代謝所需要的各種營養(yǎng)，
例如，包括十幾種必須氨基酸及其他多種非必須氨基酸、維生素、碳水化合物及無機鹽類等，其中很多成分采用血清、胚胎浸出液等提供。在很多情況下需加入10％的胎牛或小牛血清。血清使用前必須經(jīng)過鑒定，只有無菌、無內(nèi)毒素、無溶血或低溶血、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)素達一定標準以上的血清才能使用。
動物細胞的培養(yǎng)基一般可分為天然、合成、無血清培養(yǎng)基幾種。
四．細胞培養(yǎng)方式
1、貼壁培養(yǎng)：其主要適用于貼壁依賴性細胞，一般源于實體組織的細胞需要相互依賴，需貼附于不起化學作用的物質(zhì)（玻璃或塑料等無活性物質(zhì)）的表面生長、生存和維持，并**終在附著面生長**單層，鋪滿平面時便會發(fā)生接觸抑制。
2、懸浮培養(yǎng)：懸浮適應細胞、源于循環(huán)系統(tǒng)的細胞及腫瘤細胞等非貼壁依賴性細胞無需支撐面，細胞或細胞聚集體懸浮液于液體培養(yǎng)基中增殖，懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細胞培養(yǎng)的理想方式。
3、灌注小室培養(yǎng):將細胞接種于一個由上而下的蓋玻片于一個金屬圈密封圍城的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室內(nèi)的側面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出。這種方法的顯著特點是營養(yǎng)液可以循環(huán)供應，細胞生長可以盡量少受代謝產(chǎn)物積累的影響。
4、固定化培養(yǎng)：它是一種包埋培養(yǎng)方式，適用于貼壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞。它具有剪切力低、傳遞效率好和抗污染能力強、細胞生長密度高、產(chǎn)物易于收集和分離純化等特點。
（1）微載體：
微載體細胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術，這種培養(yǎng)技術是在生物反應器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒（微載體），使細胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大地附著表面，1g微載體其比表面積可達6000cm2，從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。
微載體的直徑在60~250um，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì)，因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養(yǎng)具有以下特點：①比表面積大，單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；②采用均勻懸浮養(yǎng)，無營養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度；③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況；④細胞收獲過程相對簡單，勞動強度小；⑤培養(yǎng)基利用率高，占地面積小；⑥放大容易，G外已有公司以1000L規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細胞來生產(chǎn)β-干擾素。但其缺點是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細胞；接種密度高；微載體吸附力弱，不適合培養(yǎng)懸浮型細胞。
（2）包埋：
將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細胞的方法稱為包埋。此法步驟簡便，條件溫和，負荷量大，細胞泄露小，因細胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護，細胞能抗機械剪切。但該法也有一定的缺點，如擴散限制，并非所有細胞都處于**佳營養(yǎng)物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴性細胞的固定化，多孔凝膠是**常用的載體，用于動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。#p#分頁標題#e#
（3）中空纖維：
中空纖維細胞培養(yǎng)技術模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，；利用人工的“毛細血管”—中空纖維來提供給細胞生長的營養(yǎng)。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由3~6層空心纖維組成，培養(yǎng)時將待培養(yǎng)細胞接種于空心纖維的外腔。
中空纖維技術的優(yōu)點是無剪切、高傳質(zhì)、營養(yǎng)成分的選擇性滲入，使培養(yǎng)細胞和產(chǎn)物密度都可達到比較高的水平。缺點是膜的污染和堵塞，觀察困難，細胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞纖維。該技術的發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間生長，已達到更高的細胞培養(yǎng)液密度。目前，已開發(fā)由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構建的空心纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。
（4）微囊化：
它的技術要點是在無菌條件將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)。生長介質(zhì)為1.4％海藻酸鈉溶液，半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或七升式反應器系統(tǒng)。實驗證明，采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細胞生成單克隆抗體，在7~27天微囊內(nèi)抗體濃度可達1250~5300mg/L.利用微囊包裹具有特定功能的組織細胞，形成免疫隔離的人工細胞，以此植入疾病動物或病人體內(nèi)。
它的優(yōu)點在于：①可防止細胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷；②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細胞密度和產(chǎn)物含量。缺點是：①微囊制作復雜，成功率不高；②微囊內(nèi)死亡的細胞會污染正常產(chǎn)物；③收集產(chǎn)物必須破壁，不能實現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。
五．動物細胞培養(yǎng)的生物反應器
1、生物反應器特點：動物細胞沒有細胞壁，非常脆弱，對剪切力敏感，大多需要貼壁生長，因此傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵罐不適合于動物細胞培養(yǎng)，需要進行反應器結構改造以及特殊載體的選擇。一般情況下，用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器應具備如下特點：
①混合系統(tǒng)設計應能提供均勻、溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。
②反應器內(nèi)空間利用率高，選用合適的載體系統(tǒng)和材料；
③能嚴格保證無菌環(huán)境。
④能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和CO2濃度等條件。
⑤能夠方便、快捷地實現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的采樣和觀察。
2、生物反應器類型：
(1)攪拌式生物反應器
攪拌式反應器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力，它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性，因此在生物反應中被廣泛使用。但由于動物細胞沒有細胞壁的保護，因此對剪切作用十分敏感，直接的機械攪拌很容易對其造成損害，傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應器用作動物細胞的培養(yǎng)顯然是不合適的，所以，動物細胞培養(yǎng)中的攪拌式反應器都是經(jīng)過改進的，包括改進供氧方式、攪拌槳的形式及在反應器內(nèi)裝輔件等。
A、供氧方式的改進
一般情況下，攪拌式反應器還常伴有鼓泡，為細胞生長提供所需氧分。由于動物細胞對鼓泡的剪切也很敏感，所以人們在供氧方式的改進上做了很多工作。
籠式供氧是攪拌式動物細胞反應器供氧方式的一種，即氣泡用絲網(wǎng)隔開，不與細胞直接接觸。反應器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力，以滿足細胞生長的要求。北野招一報道了一個經(jīng)過改進的攪拌式動物細胞反應器，整體呈梨形，攪拌**于反應器底部，在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動，軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)與絲網(wǎng)內(nèi)測鼓泡，絲網(wǎng)外側的細胞不與氣泡直接接觸。
B、攪拌槳的改進
攪拌槳的形式對細胞生長的影響非常大，這方面的改進主要考慮如何減小細胞所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進，并在反應器內(nèi)加裝了輔件，實驗證明改進后的反應器適用于剪切力敏感的細胞進行高密度培養(yǎng)，反應器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳，頂部法蘭蓋上安裝了3塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為30°，垂直插入液面擋板的存在減小了液面上的漩渦，這個反應器維持較小的剪切力，實驗中用于昆蟲細胞的培養(yǎng)，**終的培養(yǎng)密度達到6×106個/ml,成活率在98％以上。
（2）非攪拌式生物反應器
攪拌式生物反應器用于細胞培養(yǎng)存在的**大缺點是剪切力大，容易損傷細胞，雖然經(jīng)過各種改進，這個問題仍很難避免。相比之下，非攪拌式攪拌器產(chǎn)生的剪切力較小，在動物細胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強的優(yōu)勢。
A、填充床反應器
填充是在反應器中填充一定材質(zhì)的填充物，供細胞貼壁生長。營養(yǎng)液通過循環(huán)灌流的方式提供，并可在循環(huán)過程中不斷補充。細胞生長所需的養(yǎng)分也可以在反應器外通過循環(huán)的營養(yǎng)液攜帶，因而不會有氣泡傷及細胞，這類反應剪切力小，適合細胞高密度生長。
B、中空纖維反應器
其由于剪切力小而廣泛用于動物細胞的培養(yǎng)。這類反應器由中空纖維管組成，每根中空纖維管的內(nèi)徑約為200um，壁厚為50~70um.管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透過膜擴散，動物細胞貼附在中空纖維管外壁生長，可以很方便地獲取氧氣。
C、氣升式反應器
有人在氣升式反應器中利用微載體培養(yǎng)技術，研究了Vero細胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應器中懸浮微載體培養(yǎng)Vero細胞，在加入適量保護劑，營養(yǎng)供應充足的情況下，細胞可以正常生長**長滿微載體表面，終度可達1.13×106個/ml。
六．存在的問題與展望#p#分頁標題#e#
體外動物細胞培養(yǎng)中銨離子、乳酸和CO2的積累對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平，抑制細胞生長，需要及時改善培養(yǎng)環(huán)境。細胞凋亡是大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié)，用基因工程方法將bcl-2基因這種細胞凋亡抑制基因?qū)爰毎蔀楸姸嘌芯空叩倪x擇。Bel-2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細胞凋亡，減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗，提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量，培養(yǎng)基中所添加的血清主要來源于動物或人，但存在潛在的污染源、不同批間蛋白含量差異大及價格高等缺點。有些細胞株依賴于血清源性生長因子的特性可通過分子遺傳途徑予以改變，即導入特異生長因子的基因，使細胞能合成自身的生長因子來滿足細胞生長的需要，面對細胞生長無副作用。另外導入一些基因改變細胞圣戰(zhàn)周期的調(diào)控也可使細胞在無血清蛋白培養(yǎng)基中生長。只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細胞生長的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等，不少細胞既能在無血清供應的情況下生長，通過細胞工程方法使細胞高水平表達外源基因并正確加工表達產(chǎn)物，從而提高整個表達系統(tǒng)的產(chǎn)率，也成為應用大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)外源目的基因的研究的重要手段，改善細胞環(huán)境是當前眾多生物反應器及控制器研究者的不懈努力方向。隨著對細胞生長和產(chǎn)物生長之間相關性研究的深入，對生物反應器更多培養(yǎng)狀態(tài)參數(shù)的在線檢測以及各種新細胞生物反應器系統(tǒng)的開發(fā)利用，，新的培養(yǎng)控制模式將會在現(xiàn)有基礎上不斷產(chǎn)生。
經(jīng)過幾十年的研究與實踐應用，動物細胞培養(yǎng)技術已日趨完善，發(fā)展方向?qū)⒓性诟倪M細胞特性優(yōu)化細胞環(huán)境，擴大生產(chǎn)規(guī)模和
提高目的產(chǎn)物與產(chǎn)量等幾方面。
(1)開發(fā)能高密度生長、能分泌大量目標產(chǎn)品的細胞系。
(2)研制細胞生長性能優(yōu)良、吸附細胞容易、解離細胞容易并能重復使用的新型微載體。
(3)研制規(guī)模化生物反應器，實時監(jiān)測系統(tǒng)，剪切力小，、混合性能好的新型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)。
(4)設計新的適合于各個體細胞株的無血清、無蛋白培養(yǎng)基，使生物制品更安全。
(5)開展三維細胞培養(yǎng)及組織工程研究。